GlnR和Fnr介導植物乳桿菌WU14的Nir表達調控機制

亞硝酸鹽是一種潛在的致癌物，隨著人們食品安全意識的提高，腌制食品中亞硝酸鹽污染的安全問題日益受到關注，這也是腌制食品生產中普遍面臨的問題。因此，如何降解亞硝酸鹽是腌制食品生產中亟待解決的關鍵問題，也是食品安全領域的研究熱點。
作者及其團隊成員在國家自然科學基金、江西省自然科學基金、江西省科技支撐計劃項目、廣東省自然科學基金、廣東省普通高校重點領域專項等項目的資助下，長期開展乳酸菌來源的食品級亞硝酸鹽還原酶動態降解食品腌制過程中所產生的亞硝酸鹽的理論和技術研究，在乳酸菌功能基因挖掘和基因調控、氮代謝和稀有糖生物轉化等領域取得了一系列的成績，在乳酸菌GlnR調控GAD機制、GlnR與Nir相互作用及表達調控機制、Fnr和Fur參與植物乳桿菌WU14亞硝酸鹽降解的調控機制和高產D-塔格糖工程菌株構建與生物轉化、耐熱性和N-糖基化分子改良提高植物乳桿菌WU14 L-阿拉伯糖異構酶催化效率等方面取得了積極成果，在國內外高水平期刊上發表了數十篇學術論文，授權了多項國家發明專利，研究成果為乳酸菌氮代謝調控研究和亞硝酸鹽生物降解的發展提供了理論指導和技術支撐。
本書是對植物乳桿菌WU14全局性調控蛋白GlnR和Fnr對Nir表達調控機制研究的系列成果的總結。全書分為7章，比較系統地從理論和技術等方面介紹了植物乳桿菌WU14利用亞硝酸鹽還原酶生物動態降解亞硝酸鹽的基因調控機制，具體是在系統介紹腌制食品中亞硝酸鹽對人體的危害、亞硝酸鹽還原酶的分類和功能以及植物乳桿菌的氮代謝調控因子GlnR和Fnr研究現狀的基礎上，詳細介紹了植物乳桿菌WU14的Nir基因的食品級細胞內高效誘導表達、Fnr和GlnR的重組表達和純化、Fnr和GlnR與Nir啟動子的相互作用以及Fnr和GlnR與Nir的相互作用與表達調控機制。
本書由廣東石油化工學院徐波教授撰寫。本書撰寫過程中，中國農業科學院姚斌院士、石鵬君研究員、伍寧豐研究員、張偉研究員等給予了大力支持，應碧、昌曉宇、羅艷、孫志軍、曾浩、繆婷婷、邱胡林和沈風飛等研究生也為本書的完成付出了辛勤的勞動，在此表示衷心感謝！
本書是作者研究團隊對乳酸菌亞硝酸鹽還原酶動態降解亞硝酸鹽的基因和表達調控的分子機制研究的成果總結，期望能為食品微生物和益生菌研究領域的學者和學生提供一點理論和技術上的幫助。
限于作者水平，書中難免存在疏漏之處，敬請讀者批評指正。

徐波
2023年8月

徐波，1970年生，廣東石油化工學院教授，工學博士，一直致力于乳酸菌功能基因挖掘、乳酸菌基因工程和乳酸菌氮代謝基因調控等方面的研究工作。先后主持完成包括3項國家自然基金在內的多項研究課題，主持完成6項本科生、研究生教改項目，發表學術論文46篇，其中SCI論文12篇，獲教學成果二等獎1項，出版中文教材2部，申請發明專利3項。

本書為作者團隊多年從事乳酸菌分子生物學和基因調控研究系列成果的總結。以植物乳桿菌WU14為研究對象，以乳酸菌亞硝酸鹽還原酶系統的調控為突破口，主要探討了乳酸菌氮代謝全局性調控蛋白GlnR和Fnr對亞硝酸還原酶Nir的調控機制，從轉錄水平和基因表達上著手分析亞硝酸鹽脅迫下植物乳桿菌WU14全局性轉錄調控蛋白GlnR和Fnr及Nir對氧感應機制，驗證了Fnr與Nir和nir啟動子以及Fnr與GlnR的相互作用，闡明了GlnR和Fnr對nir操縱子的多層次表達調控機理，以期為構建乳酸菌氮代謝的基因轉錄網絡、明確基因轉錄的相互調控關系和關鍵調控基因提供理論和技術支持。
本書主要面向食品微生物發酵和應用研究的科研工作者，特別適用于乳酸菌功能基因挖掘和基因調控研究領域的科研工作者，期望能夠對食品微生物和益生菌分子生物學等科研工作者的研究提供幫助。

第1章緒論001
1.1亞硝酸鹽與食品001
1.1.1亞硝酸鹽在食品行業的應用001
1.1.2亞硝酸鹽對人體的危害001
1.1.3醬腌菜和泡菜中亞硝酸鹽的產生與控制002
1.2亞硝酸鹽還原酶002
1.2.1亞硝酸鹽還原酶降解亞硝酸鹽途徑002
1.2.2亞硝酸鹽還原酶的分類003
1.2.3亞硝酸鹽還原酶的功能003
1.3植物乳桿菌003
1.3.1植物乳桿菌的功能004
1.3.2植物乳桿菌的脫氮能力004
1.3.3植物乳桿菌在醬腌菜和泡菜中的應用004
1.3.4植物乳桿菌WU14005
1.4細菌氮代謝研究005
1.4.1調控因子與啟動子的相互作用005
1.4.2GlnR調控因子006
1.4.3Fnr調控因子010
1.4.4Fnr調控因子對細菌氮代謝的調控010
1.4.5luxS和HK等全局性調控因子對亞硝酸鹽代謝的調控010
1.5植物乳桿菌遺傳轉化體系011
1.5.1國內外研究進展011
1.5.2工業應用011
參考文獻012

第2章亞硝酸鹽脅迫下植物乳桿菌WU14的Nir食品級高效誘導表達及其酶學性質研究020
2.1亞硝酸鹽脅迫下植物乳桿菌WU14對亞硝酸鹽降解能力分析021
2.2Nir基因克隆和生物信息學分析022
2.3重組質粒pRNA48-Nir的構建及Nir誘導表達026
2.4植物乳桿菌WU14的基因組測序和分析029
2.5結論030
參考文獻030


第3章亞硝酸鹽脅迫下植物乳桿菌WU14中GlnR與Nir相互作用研究032
3.1Trans 1/pET-30a/Nir表達載體的構建與檢測034
3.1.1亞硝酸鹽還原酶保守片段Nir的獲取034
3.1.2Nir誘導表達載體的構建034
3.1.3Nir蛋白誘導與SDS-PAGE分析034
3.2植物乳桿菌GlnR基因克隆和表達載體的構建與檢測036
3.2.1T3-glnR構建036
3.2.2pET-30a-glnR的表達載體構建036
3.3GlnR與Nir啟動子體外相互作用研究037
3.3.1pNir啟動子基因擴增及Trans1/T3/pNir菌落PCR驗證037
3.3.2GlnR基因片段的重新獲得037
3.3.3誘餌載體與表達載體的構建038
3.3.4細菌單雜交實驗誘餌載體與表達載體酶切驗證039
3.4結論043
參考文獻044

第4章亞硝酸鹽脅迫下植物乳桿菌WU14中GlnR與Nir表達調控機制研究046
4.1利用酵母雙雜交研究GlnR與Nir的互作與表達調控046
4.1.1亞硝酸鹽還原酶（Nir）基因和GlnR基因的克隆046
4.1.2GlnR-pGBKT7誘餌載體和報告載體Nir-pGADT7的構建046
4.1.3菌落PCR檢測重組載體pAD-Nir和pBD-GlnR047
4.1.4融合載體的自激活和毒性檢測047
4.1.5亞硝酸鹽還原酶（Nir）和調控蛋白GlnR相互作用分析048
4.1.6植物乳桿菌WU14 RNA的提取048
4.2凝膠阻滯驗證GlnR蛋白與Nir互作和表達調控049
4.2.1PCR擴增GlnR基因050
4.2.2pPIC9-GlnR表達載體的構建051
4.2.3SDS-PAGE分析重組載體pPIC9-GlnR的表達產物051
4.2.4pE-T30a-GlnR表達載體的構建051
4.2.5GlnR蛋白的誘導表達與純化052
4.2.6GlnR蛋白與亞硝酸鹽還原酶（Nir）的相互作用053
4.3qRT-PCR實驗分析亞硝酸鹽脅迫GlnR對Nir的表達調控作用053
4.3.1WU14生長曲線測定054
4.3.2實時熒光定量PCR（qRT-PCR）054
4.4結論057
參考文獻059

第5章Fnr參與植物乳桿菌WU14亞硝酸鹽降解的調控機制061
5.1Fnr和GlnR的重組表達和純化061
5.1.1fnr和glnR基因擴增及序列分析061
5.1.2Fnr和GlnR克隆載體的構建062
5.1.3Fnr和GlnR重組表達質粒的構建063
5.1.4Fnr和GlnR重組蛋白的誘導表達、純化和檢測064
5.2凝膠阻滯（EMSA）驗證Fnr和GlnR與nir啟動子的相互作用067
5.2.1PglnR和Pnir啟動子序列的擴增生物素標記067
5.2.2EMSA驗證Fnr與Pnir啟動子的互作068
5.2.3EMSA驗證GlnR和Pnir啟動子的互作069
5.2.4EMSA驗證Fnr和PglnR啟動子的互作069
5.3qRT-PCR驗證fnr和nir的相對表達量070
5.3.1不同培養條件下植物乳桿菌WU14的生長曲線070
5.3.2植物乳桿菌WU14降解NaNO2能力測試072
5.3.3植物乳桿菌WU14的RNA提取073
5.3.4RNA反轉錄074
5.3.5fnr和nir相對表達量驗證074
5.4結論076
參考文獻078

第6章植物乳桿菌WU14 L-阿拉伯糖異構酶分子生物學、發酵工藝優化及熱穩定性分子改良079
6.1高產D-塔格糖植物乳桿菌WU14的L-AI基因的分析、食品級誘導表達及其酶學性質的研究080
6.1.1植物乳桿菌WU14生物轉化D-塔格糖分析081
6.1.2L-AI基因的擴增與TA克隆081
6.1.3高產D-塔格糖乳酸菌L-AI基因的核苷酸序列分析082
6.1.4高產D-塔格糖乳酸菌L-AI蛋白的二級結構預測分析083
6.1.5高產D-塔格糖乳酸菌L-AI蛋白跨膜螺旋分析和信號肽分析084
6.1.6高產D-塔格糖乳酸菌L-AI蛋白的三級結構預測分析084
6.1.7高產D-塔格糖植物乳桿菌WU14的L-AI酶學性質研究085
6.1.8重組PCR技術去除植物乳桿菌WU14 L-AI基因中的NcoⅠ酶切位點088
6.1.9重組質粒pRNA48-L-AI的構建及驗證090
6.1.10SDS-PAGE篩選nisin誘導L-AI基因表達的最佳誘導劑量及誘導時間092
6.1.11L.lactis NZ9000/pRNA48-L-AI重組菌的遺傳穩定性分析094
6.1.12L.lactis NZ9000/pRNA48-L-AI重組菌的L-AI酶學性質研究095
6.2植物乳桿菌WU14高產D-塔格糖的發酵工藝優化和分離提純研究098
6.2.1L-AI發酵動力學模型研究098
6.2.2D-塔格糖分離純化的研究102
6.2.3硼酸鹽催化L-AI產D-塔格糖的研究106
6.3植物乳桿菌WU14的L-AI耐熱性分子改良108
6.3.1L-AI同源建模110
6.3.2突變位點的預測111
6.3.3突變體的表達112
6.3.4野生型及突變型L-AI最適溫度及熱穩定性的測定112
6.3.5野生型及突變型L-AI最適pH及pH穩定性的測定114
6.4結論114
參考文獻118

第7章植物乳桿菌WU14 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶的基因克隆、蛋白質表達以及生物信息學分析122
7.1植物乳桿菌WU14的8個β-葡萄糖苷酶編碼基因的克隆123
7.2SDS-PAGE分析重組蛋白123
7.3目的基因BglAW14、BglBW14、BglCW14、BglDW14、BglEW14、BglFW14、BglGW14和BglHW14的生物信息學分析125
7.3.1氨基酸序列分析、跨膜結構和信號肽預測125
7.3.2氨基酸序列比對分析及系統發育樹分析126
7.3.3蛋白質二級結構預測128
7.3.4亞細胞定位128
7.4結論129
參考文獻129